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外顯子組測序（ES）：革命性的診斷工具在單基因疾病中的應用和快速外顯子組測序（RES）的重要性
單基因（孟德爾）疾病是一種高度多樣化的疾病，可以影響身體的任何器官，雖然個體罕見，但總體上相對常見。因此，即使是經驗豐富的臨床醫師，在沒有既往臨床經驗的情況下，也很可能在執業過程中遇到其中一些疾病。在一些環境中，如新生兒和兒科重癥監護病房，特別容易出現單基因疾病的聚集。過去，診斷這些疾病一直是具有挑戰性的工作，即使成功，也可能需要數年時間。然而，外顯子組測序（ES）的出現徹底改變了這種情況，它突破了準確臨床診斷的先決條件。事實上，現在即使臨床醫師無法準確識別臨床診斷結果，也可以通過外顯子組測序（ES）來診斷單基因疾病。
雖然大多數單基因病沒有特異性療法，但并不意味著分子診斷不能為重要的治療選擇提供指導，而且分子診斷還可以幫助避免無效或有害的干預措施。由于這類疾病大多罕見，才更加凸顯分子診斷的價值。分子診斷不僅可以建立關于疾病自然史的必要知識庫，制定監測指南，與患者及其家人共享數據驅動的預后信息。而且只有在獲得分子診斷的情況下，才能準確地進行復發風險計算，這對生殖計劃至關重要。這些臨床應用的重要性促使美國醫學遺傳學和基因組學學會（ACMG）認可外顯子組測序（ES）作為一級檢測，用于具有挑戰性的單基因疾?。ㄈ缍喟l性先天性畸形和發育遲緩）的患者。
快速外顯子組測序(RES)是一種特殊類型的外顯子組測序（ES），其中從樣本接收到報告生成的整個流程被壓縮到幾小時或幾天，而不是常規臨床外顯子組測序（ES）的典型幾周或幾個月。快速外顯子組測序(RES)的資源密集性質通常在某些臨床情況下是合理的，在這些情況下，快速分子診斷被認為可以為急性臨床管理決策提供信息。自2012年開始使用快速基因組測序（RGS）以來，在重癥監護病房（新生兒和兒科）中展示了其重要價值，從最初的先鋒性故事逐漸發展為隨機病例對照研究，清楚地證明了該方法在臨床上的實用性。然而這些研究主要是在親緣關系較遠的人群中開展的，所以我們迫切需要在親緣關系較近的人群中測試快速基因組測序（RGS）的分析效果。之前我們已經有了在高度親緣關系的人群中使用快速基因組測序（RGS）的初步經驗，現在我們將新病例樣本規模擴大到了189個，并重點研究了該方法的臨床診斷效果。
快速外顯子組測序（RES）：為緊急臨床診斷提供幫助的可行研究方案
所有臨床小組都被告知快速基因組測序（RES）是一種可行的研究方案，可以為需要緊急分子診斷的患者提供幫助。我們鼓勵臨床醫生與研究團隊（FSA）代表聯系，提供病例信息。病例經過同一研究代表的評估，以便確保一致性。
本研究只納入具有合理理由需要進行快速非常規分子診斷的病例。符合條件的病例包括：
（a）需要在達到法定截止日期(受孕后120天，即妊娠18.5周)前4周內做出終止妊娠決定的產前病例；
（b）重癥監護病房（通常是新生兒或兒科）的病例，診斷不明確，需要準確診斷指導積極治療或改變現有治療方案；
（c）需要緊急決定是否適合進行肝或骨髓移植的病例。在開始采樣之前，我們獲得了所有參與者的知情同意，采樣通常是通過采集靜脈血樣本（使用EDTA管）進行的。有時也會采集唾液樣本，例如在白細胞減少癥情況下，產前病例使用羊水進行采樣。本研究已經得到當地倫理委員會的批準。
臨床醫生調查揭示：遺傳病結果具有多領域的陽性臨床效用
我們向臨床醫生進行了調查，并詢問了他們對結果的臨床效用的投入。我們使用了與Dimmock等人相同的四個領域進行評估：
第1類：患者管理和臨床結局方面的變化：我們觀察到患者在急性狀況管理或臨床治療中出現了明顯的變化。這包括篩查可能有遺傳病并發癥的患者、提供新的專科咨詢、改變藥物治療方案、進行有創性手術的決策變化（例如移植或終止手術）、改變飲食方案、影像學檢查的變化以及姑息治療。我們通過評估是否成功使用了針對特定遺傳疾病的靶向治療、避免了并發癥的發生以及提升了姑息治療的質量來評估患者的臨床結局變化。
第2類：溝通方面的變化：我們觀察到與患者家屬進行溝通時發生了變化。這包括對患者的結局、期望和預后進行更詳細的溝通和解釋。
第3類：后續檢查順序的變化：我們觀察到由于我們的結果，醫生可能會觸發額外的確證性檢查。這些額外的檢查是為了進一步確認診斷或檢測可能的并發癥情況。
第4類：其他治療變化：我們觀察到醫生可能會對進一步的咨詢、監測或研究提出不同的治療方案。
根據我們向臨床醫生的調查，我們發現當結果可以引起急性患者管理或臨床結局方面的變化，或者當結果能夠促進患者與家屬的溝通，亦或者當結果導致額外的檢查以及當結果引起其它治療方面的變化時，這些結果具有陽性臨床效用。
全新研究揭示：189例未發表的遺傳病例中的突變分析與診斷關聯
該研究包含189例尚未在任何學術出版物或醫學期刊上發表的病例。這些病例的年齡范圍從胎兒到40歲（不包括為推斷死亡兒童的病因而接受檢測的父母）。在這些病例中，有91名女性和101名男性。其中重癥監護病房占比53%，進行這些病例檢測的原因包括：
（a）其中67例屬于急性ICU管理指導；
（b）關于移植（肝臟或骨髓移植）的緊急決定問題共有90例；
（c）產前決定共有9例，以及其它原因合計有23例。
在總共82個突變中有80例發現了陽性結果。這些突變跨越67個基因，13個是新基因，47個預測功能喪失(LOF)。80例陽性結果中有69個是常染色體隱性遺傳，除去了2個非純合子的情況，其余67例均為純合子。
揭示新的基因-疾病關聯：豐富遺傳疾病的理解和診療指導
接下來，我們要講的這兩個案例研究講述了新的基因-疾病關聯，進一步豐富了我們對相關基因的認識，并為相關疾病的診斷和治療提供了指導。
第一個案例是SCYL1基因與CALFAN綜合征的相關性。在OMIM數據庫中，SCYL1僅被列為自體隱性遺傳的CCA1型脊髓小腦性共濟失調。然而，Lenz等人報道了一種名為CALFAN綜合征的新型SCYL1基因相關表型?；颊逷at-1006表現為急性肝功能衰竭和腦病，并發現其具有純合子剪接突變，支持了這種關聯。
第二個案例是GALE基因的突變與血小板減少癥的相關性。GALE基因編碼UDP半乳糖-4-表達酶，其缺乏已知會導致半乳糖血癥。令人驚訝的是，一種奠基者突變被發現引起了一種僅限于血小板減少癥的不同表型。患者Pat-1039表現為血小板減少癥、免疫性溶血性貧血、IgA和IgM降低以及反復感染，需要緊急決定進行骨髓移植。發現他純合子攜帶了相同的奠基者突變。因此，他的表型既證實又擴展了與GALE相關的這種不同表型。
Pat-1001是一個胎兒，患有胎兒運動無力癥。在進行快速基因組測序（RES）檢測時，發現他攜帶COL25A1基因的純合子截斷突變。在OMIM數據庫中，COL25A1僅列出了一個僅涉及眼部的表型（先天性眼外肌纖維化5型）。在編寫本文稿過程中，我們意識到還有其他的COL25A1相關胎兒運動無力癥的病例（正在提交修訂版文稿）。因此，這代表了一個具有臨床意義的表型擴展。
簡而言之，這意味著COL25A1基因的突變不僅僅會導致眼部問題，還可能涉及其他肌肉的普遍運動無力癥狀。這個新的發現對于我們理解該基因的作用以及相關疾病的診斷和治療具有重要意義。
意想不到的診斷結果：全外顯子測序揭示潛在遺傳性疾病的關鍵
患者Pat-1192是一個7歲的孩子，考慮將其作為一個緊急骨髓移植的候選人，用于治療患有再生障礙性貧血的兄弟姐妹。對其兄弟姐妹進行了快速外顯子組測序(RES)檢測，以診斷再生障礙性貧血的病因，并排除兄弟姐妹（潛在的供體）的可能性。令人驚訝的是，雖然沒有找到再生障礙性貧血的原因，但發現兄弟姐妹Pat-1055攜帶了一個致病性ATM基因突變，從而確立了遺傳性小腦萎縮血管擴張癥的臨床未被懷疑的診斷，并排除了作為供體的可能性。
同樣，患有青紫心臟病的患者Pat-1098出現了反復溶血危機，但沒有明確的病因。發現一個致病性G6PD基因突變令人驚訝，因為先前的檢測顯示G6PD水平正常。后來發現，這些水平是在輸血后太早測量的，無法真實反映內源性酶活性。另一個例子是患者Pat-1160，他表現出血吞噬淋巴組織細胞增多癥（HLH）的特征，并有一個嬰兒時期因類似癥狀而死亡的兄弟姐妹。令人意外的是，發現這位患者攜帶了GNS基因的純合致病性突變。目前尚不清楚這一發現與主要病癥是否有關。
簡而言之，這些案例展示了一些意想不到的診斷結果，豐富了我們對疾病的理解。它們強調了進行全外顯子測序的重要性，以揭示潛在的遺傳性疾病和相關病因，為患者的診斷和治療提供指導。
快速外顯子組測序（RES）：關鍵的臨床管理工具，改善患者的預后和避免無效治療
在許多病例中，通過快速基因組測序（RES）獲得的診斷結果對患者的臨床管理產生了顯著影響。
例如，患者Pat-1057表現出急性肝衰竭，但經過特殊的半乳糖血癥飲食管理后，癥狀完全消失。令人遺憾的是，新生兒篩查沒有檢測出這一診斷。
另一個例子是患者Pat-1088，在發現他攜帶純合子TCN2基因突變引起的鈷胺素缺乏后，他表現出全血細胞減少癥、骨髓異常增生綜合征、外周血中5%原始細胞、輕度發育遲緩、皮膚色素沉著異常和腸梗阻。然而，在對他進行羥基鈷胺素注射后，他的臨床狀況有了顯著的改善。
還有患者Pat-1106，在補充鳥氨酸并限制蛋白質攝入后，他的癥狀完全恢復。經過進一步檢查發現，他患有高鳥氨酸血癥-高氨血癥-同型瓜氨酸血癥綜合征，該綜合征與slc25a15基因相關。
當PICU團隊告知患者Pat-1132的父母，他的病情非常嚴重，患有進行性肌無力、延髓麻痹和呼吸衰竭，預后不太樂觀時，他們差不多決定放棄進行復蘇（DNR）措施。然而，在發現了與slc52a3基因相關的核黃素轉運體缺陷后，立即給予核黃素治療，患者的臨床狀況迅速顯著改善，且目前正在門診隨訪中。
需要注意的是，雖然SLC52A3和TCN2基因突變仍被認為是不確定意義的突變（VUS），但我們選擇這些例子，是因為最近的研究提倡根據預期的治療反應來進行診斷和治療的決策。
總之，這些案例突出了快速基因組測序（RES）在診斷和治療中的重要性，為醫生提供了寶貴的指導和決策依據，以改善患者的臨床狀況。
有一些患者在接受快速基因組測序后發現了一些不確定意義的突變（VUS）。例如，Pat-1142患有mthfr相關同型半胱氨酸尿，出現了快速認知功能下降，還有廣泛的腦血管病變和身體內的血栓形成。然而，在適當的治療下，該患者取得了顯著的臨床改善。
另外，有一些分子診斷導致了無效治療的停止。例如，患有plce1相關腎病綜合征的患者Pat-1117停止了類固醇和免疫抑制劑治療，并接受了腎移植，因為分子診斷表明這些治療對其無效。而患有kcnj11相關先天性高胰島素血癥的患者Pat-1119停用了二氮嗪藥物，而選擇接受胰腺切除手術，取得了良好的效果。另外，患有神經鞘瘤病的患者Pat-1146經過基因測序發現其病因是神經鞘瘤病而非nf1相關的神經纖維瘤病，因此避免使用了selumetinib藥物。
這些案例突出了快速基因組測序在改善患者的臨床狀況方面的重要性，為醫生提供了指導，并避免了無效治療的發生。
快速外顯子組測序（RES）：為患者提供確切的診斷標簽和疾病預后信息
在大多數情況下，臨床醫生非常高興能夠在進行基因組測序之前給患者一個確切且無疑義的診斷標簽。他們可以向患者解釋疾病的自然發展過程，并提供有關疾病預后的相關信息。這使得患者和其家屬更清楚地了解病情，并知道可能會發生什么。
分子診斷：確認診斷的關鍵工具而非引發更多檢查的來源
根據數據，分子診斷只觸發了很少一部分的確證性檢查，這并不包括與并發癥或其他疾病特征相關的篩查。換句話說，大部分情況下，分子診斷并沒有引發更多的確診性檢查，而是更多地用于確認已有的診斷。
多致病突變的遺傳疾?。簭碗s風險評估與生殖咨詢的重要性
在絕大多數陽性病例中，致病性突變是以常染色體隱性遺傳方式傳遞的。這意味著可以向患者的父母提供生殖咨詢，例如胚胎植入前遺傳學檢測或產前診斷，以確保未來孩子的健康。
然而，在有些情況下，發現多個致病突變使得復發風險變得更加復雜。例如，患者Pat-1000在懷孕期間發現了致病性FARS2突變，而另一個已故兒童則有不同的表型（嚴重低張力），并被發現攜帶家族性FARS2突變。為了確定風險，需要對這對夫婦以及另一個已故孩子的DNA樣本進行更詳細的遺傳學檢測。結果顯示了LMOD3和BRCA2基因的純合子突變，最終確診為桿狀體肌病。
在這種情況下，復發風險從1/4 提高到了7/16，并向夫婦提供了產前診斷的選擇。如果是常染色體顯性突變，并且已經確認新生兒的狀態，則可能需要對父母進行檢測，以了解最小遺傳風險，并討論親代嵌合的可能性。在本研究中，只有一名患者（Pat-1052）觀察到多位點致病突變，該患者攜帶了BRCA2和DCAF17基因的純合子突變。這表明疾病的發病可能涉及多個基因。需要強調的是，我們在統計這些數據時僅考慮了所有突變均可能致病的情況。
快速外顯子組測序（RES）：為罕見疾病診斷帶來巨大成本節省
根據我們的研究結果，每個樣本的快速基因組測序（RES）費用為2000美元。根據這個價格，這189個病例的總診斷費用為37.8萬美元。
18歲以下的罕見疾病患者平均年醫療費用為80,436美元。在我們的研究中，接受治療的患者平均年齡約為3歲。因此，我們估計這189名患者的每年治療費用為1520.2404萬美元。診斷費用占到總年度費用的2.48%。
特別是，在研究中有26例陽性病例需要進行骨髓移植或肝臟移植，手術的總成本為1462.8萬美元。快速基因組測序（RES）診斷費用占到總年度治療和手術費用的1.27%。
快速基因組測序（RES）的結果促使80例病例接受生殖咨詢，每個病例都有可能阻止未來一個或多個患病嬰兒的出生。根據保守估計，這80例病例將阻止25%的兄弟姐妹患病，從而每年節省160.872萬美元的醫療費用，乘以平均年壽命。同樣，快速基因組測序（RES）的結果改變了9例患者的治療方法，避免了昂貴和禁忌的移植手術（6例肝臟移植和3例骨髓移植），節省了252.6萬美元。
此外，快速基因組測序（RES）的結果將3例重癥監護室患者的治療轉為姑息護理和不復蘇狀態，節省了19.867萬美元的費用。假設這些患者平均在重癥監護室停留30天，僅僅從這個群體中，快速基因組測序（RES）就能夠節省超過433.339萬美元的醫療保健成本，這意味著至少節省了395.539萬美元。
快速基因組測序的臨床效用和經濟價值：親緣關系較近婚配人群的特殊機會和測序技術的考慮
自從2012年首次引入以來，快速基因組測序或快速外顯子組測序因其在精準醫學中具有潛在的高診斷效果，受到越來越多的關注。它可以降低成本，改善資源利用，已經得到證明，并且在家長滿意度方面得分較高。重要的是，多個研究小組已經證明了其臨床效用，通常應用于新生兒和小兒ICU。同樣，我們需要堅實的數據來證明快速基因組測序或快速外顯子組測序的臨床效用，以合理地覆蓋這種比傳統外顯子組測序成本更高的特殊工作流程。這些數據應該包括不同的環境，包括親緣關系較近婚配人群，這在快速基因組測序或快速外顯子組測序的臨床有效性研究中很大程度上是缺乏的。
親緣關系較近婚配人群的自交性增加了發現罕見或新的遺傳突變的可能性，為快速基因組測序或快速外顯子組測序的臨床應用提供了機會。這在我們的研究中很容易看到，其中有幾個診斷病例非常罕見，甚至還沒有在OMIM中列出。我們先前的研究表明，超過90%的家庭在接受咨詢后會做出積極的生殖決策，例如產前診斷或胚胎植入前遺傳測試。
在考慮快速外顯子組測序的臨床效用時，還需要考慮所采用的測序技術的背景。離子通道快速外顯子組測序提供了單樣品運行和速度方面的靈活性和經濟優勢。然而，本研究中使用的離子通道外顯子組展示了對插入缺失的敏感性降低，特別是在同源聚合性區域。因此，雖然這影響的病例數量很少，但這仍然是離子通道測序的一個嚴重限制，在應用于這種情況時應予以考慮。
從經濟的角度來看，對于我們的患者群體，僅考慮年度醫療費用和程序費用（如肝臟或骨髓移植），快速外顯子組測序的應用僅占總費用的很小一部分（1.27%）。然而，從罕見病患者的終身醫療費用的角度來看，快速外顯子組測序的費用相對較低，測試和臨床價值的證明被顯著放大。在本研究患者群中，應用快速外顯子組測序所節省的醫療費用遠超快速外顯子組測序費用。
結 論
這項研究顯示，在我們的親緣關系較近婚配人群中，快速外顯子組測序（RES）具有很高的臨床效用，使用了與之前在非親緣關系較近婚配人群中相似的定義。此外，我們強調了在這種特殊情況下的臨床效用的幾個獨特方面。我們希望我們的結果能夠增加支持將快速外顯子組測序作為急性病例的標準臨床檢測的證據。
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